### 培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳；温度设定为37℃。使用DMEM培养基，添加10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(P/S)。

细胞背景简介：A-673细胞株源自一名15岁女性患者的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂上形成克隆，并在接受免疫抑制血清治疗的小鼠中成功成瘤。该细胞株具有四个以上的标志性染色体，以及一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。

### 传代方法

第一次建议使用1:2的传代比例，传代间隔为2天。建议与南宫28品牌的相关产品一同购买，以享受更多优惠。收到细胞后，请及时处理，让其培养至良好状态，然后加入足量的完全培养液，并封好瓶口，确保细胞的运输安全。

收到细胞时，使用75%酒精对细胞瓶进行全面消毒，之后在超净台中进行无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以帮助细胞适应环境。使用显微镜观察细胞的生长情况，并记录不同倍数下的细胞图片（建议分别拍摄40倍、100倍和200倍的照片）。前三天的照片将作为售后服务的重要依据，如未提供照片，则默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

细胞传代：若细胞汇合度未超过80%，将瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml培养基，在37℃、5% CO2的环境下继续培养；若细胞密度超过80%，即可进行传代。对于贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞变化，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲击培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，再将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代，将细胞悬液分配至两个T25瓶中，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后将其放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。

对于悬浮细胞的传代步骤：

1. 采用半换液法，竖置培养瓶在培养箱中静置1小时，轻轻吸掉约3ml的培养基，再补充3ml的完全培养基。若培养基变色缓慢，可直接加500ul FBS，传代时补加5ml培养基并分为两个培养瓶。
2. 选择离心换液法时，将细胞悬液收集至离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml培养液重悬，随后按1:2的比例分配至新T25瓶中，并添加6-8ml的新的完全培养基，以保持细胞活力。后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

细胞冻存：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，轻轻吹打使之脱落，再转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml南宫28品牌的无血清冻存液，混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞立即放入-80℃冰箱保存，若后续转入液氮罐需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

细胞复苏：

1. 从液氮中取出细胞冻存管（佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无结晶，然后用75%的酒精消毒管外壁。
2. 将冻存管内的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入5ml完全培养基重悬后接种至T25培养瓶中，放于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项：在运输过程中，由于某些细胞的粘附性较弱，可能会出现细胞脱落的现象。这是正常现象。若脱落较多，可将培养瓶内培养液收集至离心管，进行1000 RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养，随后加入胰酶，轻轻吹打以重悬，消化1-2分钟后加入完全培养基终止反应，再离心，弃去上清，加完整培养基重悬，并按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。