南宫28大鼠肝星形细胞THSC培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：大鼠肝星形细胞THSC

生长特性：无血清冻存液，培养体系为DMEM。

传代方法：首次建议1:2的比例进行传代，换液频率为每2天一次。

备注：培养基需使用无菌离心管收集，若对比培养效果不理想，建议直接购买我们的完全培养基。

二、细胞接收后处理

收到细胞后，应立即培养至健康状态，然后灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳做法。取出细胞时，使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，随后在超净工作台内进行无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续操作。建议在显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好在40x, 100x, 200x下各一张），前三天的照片为重要的售后依据。如不提供照片，默认收到状态良好。

在传代操作中，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一个使用自配的完全培养基，以便对比培养。换液后请将瓶盖轻松拧松。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

在细胞未达到80%的汇合度时，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基并置于37℃、5% CO2的孵箱中培养；若细胞密度超过80%，即可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况。若细胞大部分变圆并脱落，迅速返回操作台，轻轻敲打培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出悬液，转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml的完全培养基重悬细胞。
4. 按照1:2的比例将细胞悬液分瓶培养（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞变化，待细胞回缩并变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，轻轻吹打使其脱落，转移至15ml离心管中并以1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml的南宫28无血清冻存液，充分混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存管直接放入-80℃冰箱保存。如果后期需要转入液氮罐，须在-80℃下储存24小时以上。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，再用75%酒精擦拭管外壁。
2. 将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞重悬于5ml的完全培养基，然后接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。
4. 次日，需更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

运输过程中，有些细胞可能因附着不牢而发生脱落，这是正常现象。如脱落较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟以作过渡培养（可用于后期对比培养）。沉淀后加入1-2ml胰蛋白酶，轻拍以重悬，消化1-2分钟后再加5ml的完全培养基终止反应。再离心、弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

五、售后条款

1) 重发细胞的情况及判定标准

1. 细胞在运输途中遇到各种问题，如丢失、破损、液体泄漏等，需重发。
2. 如收到产品后48小时内出现污染，与真实的实验结果核实后，亦可重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时若大多数细胞未存活（需提供细胞状态照片），可重发。
4. 如干冰运输细胞复苏后24小时未存活或常温运输的细胞静置4小时且未开封出现污染，需重发。
5. 细胞活性问题，需在收到产品7天内提供真实实验结果（用台盼蓝染色法鉴定），经技术人员核实后可重发。
6. 在收货当天以及第二、第三天需拍照，若在三天内未告知，视为产品合格。若在4-7天内出现问题，需提供收到细胞前三天的照片以及问题出现时的照片，技术人员将根据详细操作步骤判定责任，如属我方责任则重发。

2) 不予重发的情况

1. 因客户造成的细胞污染将不重发。
2. 客户因错误操作导致细胞状态不佳的情况不重发。
3. 使用非本库推荐的培养体系导致细胞状态不佳不重发。
4. 细胞状态不佳且未提供前三天照片的不予重发。
5. 细胞培养时经过其它处理的，不重发。
6. 在收到产品2天内未告知的问题，不重发。
7. 视具体情况处理。

以上内容为南宫28提供的大鼠肝星形细胞THSC的培养指南，确保操作规范，有效维护细胞状态。