## 细胞裂解液的制备

### 一、试剂准备

1. 新鲜制备的冷RIPA裂解缓冲液：

• 150 mM NaCl
• 1% NP-40（去垢剂）
• 0.1% SDS（去垢剂）
• 2 µg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前添加）
• 2 µg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前添加）
• 1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
• 15 mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
• 1 mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，可选）

以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCl溶液中。

2. 在冷PBS中加入：

• 1 mM PMSF
• 15 mM EDTA
• 1 mM Na Vanadate（可选）

3. 确保使用生长良好的对数期细胞，使用75 cm²培养瓶至少3-4个（90%以上生长面积）。

### 二、实验步骤

1. 将充满细胞的培养瓶置于冰上，通过吸液管吸出培养液。加入足够的冷PBS洗涤细胞表面，以去除残余培养基，倒掉PBS，并重复此步骤2-3次。在最后一次洗涤时，尽量吸干残留的PBS，避免温度升高。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75 cm²培养瓶添加1 ml），然后用细胞刮子沿瓶壁刮取细胞。如果需处理的细胞有多瓶，则将第一瓶刮取的细胞液转移至下一瓶继续刮取（由于细胞裂解液较粘稠，请使用直径较大的吸液管）。

3. 将刮取的细胞裂解液置于14 ml离心管中（放置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩余细胞。

4. 尽量收集尽可能多的细胞裂解液到14 ml离心管中，将样品放入冰盒中进行超声处理，超声强度需控制在不产生泡沫为宜，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应以10000 rpm速度离心10分钟，收集上清液。

5. 取少量细胞裂解液测定其蛋白浓度（可使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计在A280处测量），将样品分装并保存于-70℃。

### 细胞裂解方法

细胞裂解一般采用物理或化学方法：

#### 物理法：

1. 反复冻融：将细胞在-20℃与25-30℃环境下反复冷冻和解冻10-20次，适用于大多数哺乳动物细胞，例如血细胞。
2. 煮沸法：将细胞在100℃沸水中加热5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
3. 超声法：使用超声波破碎仪对细胞进行超声处理，适用大部分微生物细胞。
4. 渗透压法：将薄弱细胞膜的细胞浸泡在纯水等低渗溶液中，使细胞吸水破裂。
5. 液氮法：植物细胞常用液氮研磨法进行裂解。

#### 化学法：

1. 强酸、强碱溶液：例如使用0.5 N NaOH溶液裂解大部分动物细胞和微生物细胞。
2. 生物酶：可用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。

在生物医疗领域，掌握有效的细胞裂解技术至关重要。选择合适的细胞裂解方法和试剂将有助于提高实验的准确性和效率。使用南宫28品牌的优质试剂和设备，可以进一步提升实验结果的可靠性。