近期，许多同学向小尚反馈关于细胞复苏不成功的问题。细胞复苏作为细胞培养中的一项常规操作，实际上涉及多种细节，稍有不慎就可能导致复苏失败，这与冻存和复苏的具体操作密切相关。下面我们将从冻存的角度展开分析，下周将更新有关复苏操作原因排查的内容，欢迎同学们关注和收藏~

冻存步骤回顾

在进行细胞冻存时，务必遵循以下步骤：

1. 提前准备好冻存液备用；
2. 离心获得细胞沉淀后，用冻存液轻轻重悬细胞；
3. 将细胞悬液转移至冻存管中；
4. 若使用程序冻存液，将冻存管放入程序冻存盒，并置于-80℃冰箱过夜，之后转入液氮保存；若使用非程序冻存液，则不需要冻存盒。

冻存过程中常见错误操作

以下是几个常见的冻存错误及其解决方案：

1. 使用常规冻存液时缺乏保温措施

在使用含血清的冻存液（培养基+血清+DMSO）时，若未使用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施，降温过快会导致细胞破裂死亡。推荐使用市售的程序冻存盒，以确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。没有冻存盒的同学可将冻存管放在泡沫盒中，4℃静置5-10分钟后，转入-20℃静置2小时，再放入-80℃冰箱过夜，第二天转入液氮保存。

2. 冻存前细胞状态不佳或密度过低

良好的细胞状态是复苏成功的基础，建议选择对数生长期、汇合度在80%以上的细胞进行冻存。若细胞培养上清变为橘黄色，最好换液并静置培养4小时后再进行冻存。冻存细胞的密度应保持在200-300万/mL/管为宜。

3. 直接将DMSO加入细胞悬液

DMSO在被稀释时会产生热量，可能对较脆弱的细胞造成损伤。因此，建议提前配制好冻存液后再处理细胞，以确保细胞的存活率。

4. 未经梯度降温直接放入液氮

细胞在未经过-80℃冰箱降温的情况下直接放入液氮，会导致细胞死亡。因此，在放入液氮之前，必须经过适当的降温过程。

5. 不合适的冻存液配方

研究表明，5%-10%的DMSO最为适合细胞冻存，具体比例应根据细胞类型调整。对于DMSO敏感的细胞，应降低使用比例。根据小尚的经验，8% DMSO适用于大多数细胞系，而且需要根据培养难度调整血清比例，越难培养的细胞需要添加更多的血清。

6. 冻存条件不当或时间过久

液氮的储存条件及稳定性通常优于-80℃冰箱，因后者温度不稳定，很容易导致细胞活率下降。因此，若有条件，尽量选择液氮保存细胞。若没有液氮罐，将冻存管放在-80℃冰箱内部位置，并定期进行复苏检测以确保活性。

以上是关于细胞冻存过程中常见问题及解决方案的总结，了解这些细节对于保证细胞复苏的成功至关重要。希望同学们在使用南宫28产品时能够更加得心应手，下一步将跟进复苏操作的相关排查分析，敬请期待！